分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。HPLC分兩類：(人工合成多肽)離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。 分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到(人工合成多肽)多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反，多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的， 高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。
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