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磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分為兩步
磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分為兩步:
①末端標(biāo)記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP,有時(shí)用GTP)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)或肽底物上;
②將磷酸化的底物分離出并進(jìn)行定量分析。
前者通常在溶液中進(jìn)行,(磷酸化多肽)酶和底物均在液相中。后者為了去除游離的標(biāo)記核苷酸,通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分離或使標(biāo)記底物結(jié)合于纖維素膜上。
有時(shí)可將酶或底物固定于固相載體上,如蛋白質(zhì)混合物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,然后封閉,放入含有酶和標(biāo)記ATP的溶液中。或者更進(jìn)一步,設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白激酶分析系統(tǒng)(酶活性的原位分析),將(磷酸化多肽)蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纖維素膜上,這一方法可與標(biāo)準(zhǔn)的液相分析方法達(dá)到相等的靈敏度和線性范圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定于硝酸纖維素膜上(點(diǎn)滴或真空抽吸),然后將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中,底物蛋白質(zhì)與剩余的膜結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,然后加入同位素標(biāo)記的ATP,作用一定時(shí)間后洗去膜上未反應(yīng)的ATP并終止反應(yīng),參入物經(jīng)放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)定量,與膜結(jié)合的酶和底物均具有一定的運(yùn)動(dòng)性,兩者反應(yīng)的定量值代表磷酸化的程度。
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