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PCR
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磷酸化多肽操作步驟

磷酸化多肽操作步驟:
  1.剪一適當大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格;
  2.(磷酸化多肽)用緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上,使膜平坦;
  3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度,膜上每個點所加的樣品其激酶活性在0.5~50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉移1pmol 32P的酶量),當酶比活性在1μmol/min·mg-1時則每個點應加純酶0.5~50ng;
  4.用微量加樣器加1~5μl樣品于膜上方格中央,待液滴消失后將膜面對含有緩沖液A(包括1~10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼于玻璃平板上),在濕潤環境中23℃作用30分鐘。大片膜可密封于塑料袋中;
  5.在100ml緩沖液A中洗膜并置于一新的Parafilm膜上(加有反應混合物溶液25μl/cm2),23℃作用5~30分鐘;
  6.(磷酸化多肽)用緩沖液A 100ml洗膜4次,空氣干燥后進行放射自顯影。或切成方塊進行液閃計數定量。

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